Toksisuustesti maaperäeliöillä

Ville Selonen & Josefiina Ruponen
ville.selonen@helsinki.fi, josefiina.ruponen@helsinki.fi
Helsingin yliopisto

Työn ideana on suunnitella ja toteuttaa tutkimus hyönteistorjuntaan käytettävän deltametriinin haittavaikutuksista maaperän selkärangattomiin ja mikrobeihin. Tämän harjoitustyön avulla oppii hyödyntämään ja soveltamaan maaperätutkimuksessa yleisesti käytettyjä menetelmiä sekä tunnistamaan selkärangattomia eliöitä. Työssä voi harjoitella esimerkiksi maan mikrobien aktiivisuutta kuvastavan maahengityksen määrittämistä.

Avainsanat: kemikaalit, maahengitys, maaperätutkimus, mikrobibiomassa, mikrobit, niveljalkaiset, toksisuus, torjunta-aineet

Toksisuustestin toteutus Helsingin yliopiston ympäristöekologian kurssilla. Kuva: Ville Selonen CC BY-SA (4.0)

Johdanto

Deltametriini on yleinen, enimmäkseen niveljalkaisten torjuntaan käytettävä torjunta-aine. Sitä hyödynnetään muun muassa maataloudessa ja malarian torjunnassa. Deltametriini on synteettinen pyretroidi, joka vaikuttaa hyönteisiin sekä sisäisen että ulkoisen altistuksen kautta estäen hermon natriumionikanavien sulkeutumisen ja lamauttaen hermoston. Tämän seurauksena hermoimpulssin normaali eteneminen estyy. Deltametriini on teoriassa nisäkkäillekin myrkyllistä, mutta suurempi ruumiinkoko ja korkeampi lämpötila lieventävät vaikutuksia. Deltametriinin puoliintumisaika vaihtelee aerobisissa oloissa 11–72 vuorokauden välillä. Anaerobisissa oloissa deltametriinin puoliintumisaika on 31–36 päivää. Aine on erittäin myrkyllinen vesieliöille ja voi aiheuttaa pitkäaikaisia vaikutuksia vesistöihin joutuessaan.

Työn tavoitteena on suunnitella ja toteuttaa tutkimus, jossa selvitetään, miten deltametriini vaikuttaa torjuttavaan eliöryhmään kuulumattomiin selkärangattomiin, esimerkiksi niiden yksilömääriin ja aktiivisuuteen. Oletuksena on, että deltametriini vaikuttaa haitallisesti tutkittaviin eliöihin.

Ajankohta

Harjoitus on mahdollista toteuttaa sulan maan aikana. Tutkimus kannattaa kuitenkin ajoittaa kesäaikaan, jolloin mikrobit ja selkärangattomat ovat aktiivisia, ja niitä on runsaammin. Harjoitukseen tarvittava aika riippuu suunnitellusta tutkimuksesta, mutta aikaa olisi hyvä varata yksi työviikko. Pitkäaikaisvaikutuksia tutkittaessa tarvitaan pidempi aikajakso, jolloin koe on käynnissä. Mahdollisen kroonisen vasteen aikaansaamiseksi altistus kannattaa tehdä esimerkiksi yhden kerran kolme kuukautta ja toisen kerran kaksi kuukautta ennen vasteen määrittämistä. Akuuttivaikutusten tutkimiseen riittää yhden vuorokauden altistus.

Menetelmät

Ennen työn toteuttamista tutustu deltametriinin käyttöohjeisiin ja kemikaalikorttiin sekä suunnittele tutkimuskysymykset ja kokeen toteutus. Tutkimusaluetta valitessa kannattaa huomioida, että alueella ei ole aiemmin käytetty deltametriinitorjuntaa. Tutkimuksessa on mahdollista vertailla akuutti- ja pitkäaikaisvaikutuksia, jolloin tarvitaan kolmenlaisia alueita kontrollia ja kahta eri käsittelyä varten. Koeruutuja voi olla esimerkiksi 5 kutakin käsittelyä kohden (yhteensä 15) ja yhden ruudun koko 0,5 x 0,5 m. Kontrolli- ja käsittelyruudut tulee kastella ennen deltametriiniliuoksen lisäämistä. Altistuksessa käytetään deltametriinivalmisteen ohjepitoisuutta.

Käytettävät menetelmät ja työn suoritustapa riippuvat harjoituksessa tehtävästä tutkimussuunnitelmasta ja siinä esitetyistä tutkimuskysymyksistä. Tutkimuksessa voidaan tarkastella deltametriinin vaikutuksia esimerkiksi änkyrimatojen (Enchytraeidae) ja mikroniveljalkaisten yksilömääriin, mikrobien biomassaan ja/tai maahengitykseen. Näiden mittaamista varten koeruuduista kerätään altistuksen jälkeen kolme maaperänäytettä maaperäkairalla. Yhdestä näytteestä erotellaan änkyrimadot, yhdestä mikroniveljalkaiset ja yhdestä näytteestä mitataan maahengitys ja mikrobibiomassa.

Änkyrimatojen erotteluun maaperästä voi käyttää märkäsuppilomenetelmää ja mikroniveljalkaisten erotteluun puolestaan ”high gradient” -menetelmää. Maahengityksen määrittäminen perustuu tutkittavan maaperän tuottaman hiilidioksidipitoisuuden mittaamiseen, ja siihen tarvitaan hiilianalysaattoria. Mikrobiaktiivisuutta voi mitata käyttämällä SIR-menetelmää (SIR = substrate-induced respiration), jossa maaperään lisätään glukoosia. Tällöin glukoosi ei toimi rajoittavana tekijänä ja aktivoi myös passiiviset mikrobit.

International Chemical Safety Cards (ICSCs), deltametriinin kemikaalikortti:
http://kappa.ttl.fi/kemikaalikortit/khtml/nfin0247.htm

Aineiston analysointi

Aineiston analysointiin voidaan käyttää esimerkiksi IBM SPSS Statistics- ja PAST-ohjelmia. Tulosten käsittelyyn sopii parametrinen tai tarvittaessa ei-parametrinen yksisuuntainen varianssianalyysi. PAST-ohjelmalla voi koko aineistosta tehdä ANOSIM-monimuuttujakuvaajan sekä SIMPER-taulukon, joiden avulla voidaan kuvata käsittelyn mahdollisia suoria ja välillisiä vaikutuksia eri parametreihin.

Harjoituksen muokkausmahdollisuudet

Harjoitusta voi soveltaa monipuolisesti erilaisiin eliöryhmiin, ja sen avulla voidaan tutkia deltametriinin vaikutuksia myös eliöryhmien keskinäisiin suhteisiin. Harjoitus on mahdollista toteuttaa muullakin kemikaalilla kuin deltametriinillä.

LIITE 1

Maahengitys

Maahengitys, eli maaperän eliöiden tuottama CO₂, mitataan laborantin opastuksella Apollo 9000 Combustion TOC Analyzer -laitteella. Leikkaa kairanäytteestä ensin yli 4 cm:n ulottuva osa pois. Leikkaa sen jälkeen näyte pystysuunnassa neljään osaan ja ota yksi osanäyte hengitysmittaukseen. Poista tästä osanäytteestä tarkasti kaikki kasvinosat (sekä versot että juuret), murenna maa tasaiseksi ja sekoita hyvin. Laita sen jälkeen maata 40 ml näytepulloihin noin puolet pullon tilavuudesta (kirjaa ylös maan tarkka paino), lisää 2 ml vettä (varmistetaan, ettei kuivuus rajoita hengitystä) ja sulje septumilla varustettu korkki tiiviisti. CO₂ alkaa kertyä pullon ilmatilaan heti, kun korkki on suljettu. Seuraavana aamuna avaa korkki tunniksi, jonka jälkeen korkit kierretään tiiviisti kiinni ja asetetaan Apollon mittauskoriin. CO₂-tuoton laskemiseksi laite ohjelmoidaan ottamaan ilmanäyte pullosta 1 ja 4 tunnin kuluttua (CO₂– pitoisuuden erotus mittauskertojen välillä kertoo tuotetun CO₂:n määrän). Koska CO₂-pitoisuuden nousu riippuu pullon vapaasta ilmatilavuudesta, kunkin pullon ilmatilavuus määritetään mittausten jälkeen täyttämällä pullo vedellä ja mittaamalla tarvittavan veden määrä (esim. vaakaa apuna käyttäen). Maahengityksen yksikkö on μg CO₂-C / h / g maata kp. (käytä vesipitoisuusmittauksen arvoja kuivapainon laskemiseen) tai μg CO₂-C / h / g orgaanista ainetta.

Mikrobibiomassa SIR-menetelmällä (SIR = substrate-induced respiration)

Valmista yksi hengitysmittauksesta ylijäänyt osanäyte samoin kuin edellä hengitysmittausta varten, mutta ennen veden lisäystä ja korkin sulkemista lisää 10 mg glukoosia 1 g tp. maata kohti. Lisätty glukoosi aktivoi kaiken elossa olevan mikrobiston, joten lisäyksen jälkeisen 4 tunnin aikana mitattua hengitystä voidaan käyttää suhteellisena mikrobibiomassan mittana (mittausta ei saa jatkaa pidempään, koska tällöin mikrobit ehtivät glukoosin avulla tuottaa uutta biomassaa). SIR-tulosten yksikkönä on μg CO₂-C / h / g maata kp. tai μg CO₂-C / h / g orgaanista ainetta. Lisäksi, koska maahengityksestä yli 90 % koostuu mikrobihengityksestä, voidaan maahengityksen ja SIR-arvojen suhdeluvulla (yksikötön) arvioida mikrobien ravinnerajoitteisuutta. Mitä suurempi suhdeluku on, sitä enemmän ravinteiden oletetaan rajoittavan mikrobien kasvua (mikrobit hengittävät paljon hiiltä per biomassayksikkö silloin, kun niillä ei ole ravinteita, joiden avulla hyödyntää hiili kasvuun).

Änkyrimatojen erottelu märkäsuppilomenetelmällä

1. Kiinnitä koeputki suppilon kumiletkuun ja täytä suppilo lähes täyteen kylmällä vedellä (ei lämmintä vettä, se tappaa eläimet).
2. Leikkaa ensin kairanäytteestä yli 4 cm:n ulottuva osa pois. Punnitse näyte ja aseta se kokonaisena ylösalaisin erottelukoriin harsokankaan päälle.
3. Laita koriin tunnistelappu.
4. Aseta kori varovasti suppiloon. Vältä korin heiluttelua, jotta maa ei varise koeputkeen. Lisää vettä jos tarpeen, ei kuitenkaan korin ja maan päälle. Osa maasta voi jäädä veden pinnalle.
5. Valaise ja lämmitä näytteitä hehkulampulla (40 W) neljän tunnin ajan portaittain valaistusta lisäten. Madot pakenevat valoa ja lämpöä ja päätyvät koeputkeen.
6. Ota koeputki pois ennen kuin siirrät näytekoria, jotta roskaa variseen koeputkeen mahdollisimman vähän. Siirrä tunnistelappu korista koeputkeen, minkä jälkeen voit heittää maanäytteen pois.
7. Änkyrimadot tulisi laskea heti erottelun jälkeen, mutta tarpeen vaatiessa niitä voi säilyttää yön yli koeputkessa vähässä vedessä.
8. Änkyrimatojen lukumäärä ilmoitetaan yksilöinä / m² tai g tp. / m².

Mikroniveljalkaisten erottelu ”high gradient” –menetelmällä

Leikkaa kairanäytteestä yli 4 cm:n ulottuva osa pois, punnitse näyte ja aseta se ylösalaisin erottelurenkaaseen. Laita näytteen alaosan alle pala harvasilmäistä verkkoa ja työnnä rengas keräysastiaan, jossa 50% etyleeniglykolia ja tippa pesuainetta (hävittää vedestä pintajännityksen). Laita keräysastia ja näyte erottelijan eristelevyssä olevaan koloon ja käynnistä kylmennys ja lämmitys. Nosta lämmitystehoa asteittain ja kerää näytteet, kun kaikki maanäytteet ovat läpeensä kuivia (yleensä 5-8 vrk). Niveljalkaisten luku